Аспекты применения методов биотехнологии в селекции ярового рапса ( brassica napus L.) 06. 01. 05 Селекция и семеноводство


На правах рукописи





КОТЛЯРОВА ЕКАТЕРИНА БОРИСОВНА




АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДОВ БИОТЕХНОЛОГИИ



В СЕЛЕКЦИИ ЯРОВОГО РАПСА (BRASSICA NAPUS L.)

06.01.05 – Селекция и семеноводство




Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Рамонь - 2007

Диссертационная работа выполнена в Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский и проектно-технологи-ческий институт рапса»

Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук



Подвигина Ольга Анатольевна


Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Буторина Анастасия Константиновна


доктор сельскохозяйственных наук

Ошевнев Валерий Павлович


Ведущая организация – ФГНУ «Всероссийский научно-исследователь-ский институт масличных культур им. В.С. Пустовойта» РАСХН

Защита состоится «18» мая 2007 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.065.01 Государственного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свеклы и сахара имени А.Л. Мазлумова» по адресу: 396030, Воронежская область, Рамонский район, ВНИИСС; факс (47340) 2-19-93

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свеклы и сахара имени А.Л. Мазлумова»

Автореферат разослан «18» апреля 2007 г.


Ученый секретарь

диссертационного совета,

к. с.-х. н. Путилина Л.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность. Рапс яровой (Brassica napus L.) – ценная масличная и кормовая культура, хорошо приспособленная к умеренному климату. В России рапс является одной из перспективных масличных культур, увеличение объемов производства семян которой позволит полнее обеспечить население растительным маслом, животноводство – кормовым белком, а промышленность – сырьем (Карпачев, 2006).

Создание новых сортов рапса, соответствующих требованиям современного производства, во многом зависит от разнообразия исходного материала, который можно создавать с помощью методов биотехнологии. Одним из них является метод получения гаплоидов из репродуктивных клеток в условиях in vitro, ускоряющий процесс формирования гомозиготных линий по сравнению с традиционными методами селекции в 5-10 раз. У ярового рапса достаточно подробно разработан метод культуры изолированных пыльников. Однако, в гетерозисной селекции на основе цитоплазматической мужской стерильности необходимо сохранение материнской цитоплазмы, что возможно только с помощью культивирования in vitro неоплодотворённых семязачатков. Кроме того, растения, полученные данным методом, свободны от некоторых вирусов и нежелательных генов, передающихся по мужской линии. Сведений о получении гаплоидных растений в культуре неоплодотворённых семязачатков ярового рапса в доступной нам литературе не выявлено.

Метод культуры незрелых зародышей дает возможность получать отдаленные гибриды, что играет немаловажную роль в селекции рапса, так как перенос ценных генов из других видов и родов Brassicaceae расширяет его генетический потенциал, который отличается крайней узостью.

В связи с этим в селекции рапса применение биотехнологических методов, в том числе эмбриокультуры и гаплоидии, позволяющих расширить генетический потенциал и ускорить создание новых сортов и гибридов, является актуальным.



Цель исследований - обосновать приемы культивирования in vitro неоплодотворённых семязачатков и незрелых зародышей в процессе создания нового исходного материала ярового рапса.

Задачи исследований:

  1. Изучить влияние экзогенных и эндогенных факторов на индукцию гаплоидных регенерантов из неоплодотворённых семязачатков и формирование реституционных линий ярового рапса.

  2. Разработать способ получения нового исходного материала ярового рапса, в том числе восстановителей фертильности, с использованием метода культуры неоплодотворённых семязачатков.

  3. Изучить влияние направления скрещиваний (генотипа материнской и отцовской формы) и условий культивирования на развитие зародышей отдаленных гибридов в условиях in vitro.

  4. Выявить ценные и хозяйственно-полезные признаки полученных реституционных линий и гибридных растений.

Научная новизна. Впервые установлено, что при культивировании неоплодотворенных семязачатков ярового рапса тотипотентность клеток каллуса различается, и реализация морфогенеза происходит по пути гистогенеза и органогенеза, приводящего к формированию ростовых почек и корней. В культуре незрелых зародышей морфогенез осуществляется через прямую регенерацию, ведущую к формированию ростовых побегов. Данные наблюдения имеют теоретическое значение, так как расширяют научные представления о регуляции ростовых процессов у растений рапса при воздействии стрессовых условий культуры in vitro.

Впервые разработан метод получения гомозиготных линий рапса путем индуцирования гаплоидии в культуре неоплодотворенных семязачатков in vitro, позволяющий установить влияние эндо- и экзогенных факторов на индукцию гаплоидии, определить оптимальные стадии развития эксплантов, выявить состав и последовательность чередования питательных сред на этапах стабилизации и микроразмножения гаплоидных и реституционных линий ярового рапса. Установленные параметры культивирования неоплодотворенных семязачатков ярового рапса in vitro дали возможность впервые разработать способ, позволяющий ускоренно (в 5-10 раз) получать исходный материал для гетерозисной селекции, на который подана заявка на патент «Способ получения восстановителей фертильности ярового рапса».

Впервые модифицирован состав питательной среды для получения гибридов от межвидовых и межродовых скрещиваний путем прямой регенерации из незрелых зародышей в условиях in vitro. Установлен оптимальный срок введения зародышей изучаемых отдалённых гибридов семейства Brassicaceae в культуру. Использование метода эмбриокультуры позволило получить межродовые гибриды между рапсом яровым и горчицей белой при использовании последней в качестве опылителя, что представляет определенный теоретический интерес для отдаленной гибридизации рапса.

Практическая значимость результатов исследований.

С помощью культуры неоплодотворенных семязачатков получено 5 реституционных линий ярового рапса, которые были переданы в лабораторию селекции рапса ВНИПТИР и включены в её научно-исследовательскую работу.

Данные линии представляют ценность для использования в гетерозисной селекции в качестве восстановителей фертильности и как перспективный исходный материал для селекции ярового рапса на скороспелость, качество семян и масла, устойчивость к полеганию и другие признаки.

Полученный в ходе применения эмбриокультуры гибридный материал может использоваться в практической селекции и дальнейших фундаментальных и прикладных исследованиях. Среди полученных гибридов выявлены образцы, устойчивые к тле и с желтой семенной оболочкой.

Разработанные в процессе исследований методические подходы могут использоваться в учебных программах по биологии и селекции в высших и средних учебных заведениях и в различных областях биотехнологии.



Апробация работы. Основные положения исследовательской работы доложены и обсуждены на школах-семинарах молодых учёных Липецкой области: «Актуальные проблемы современной науки» (Липецк, 2004), «Актуальные проблемы естественных наук и их преподавания» (Липецк, 2005, 2006); III и IV Международных конференциях молодых учёных и специалистов «Актуальные вопросы селекции, технологии и переработки масличных культур» (Краснодар, 2005, 2007), школе молодых учёных «Экологическая генетика культурных растений» (Краснодар, 2005), Международной научно-практичес-кой конференции «Рапс - культура XXI века: аспекты использования на продовольственные, кормовые и энергетические цели» (Липецк, 2005), Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы преподавания молекулярной биологии, биотехнологии и вирусологии в высших педагогических учебных заведениях» (Орехово-Зуево, 2006), I (IХ) Международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006), Международной научной конференции «Проблемы биологии, экологии и образования: история и современность» (Санкт-Петербург, 2006), IX Международной научно-практи-ческой экологической конференции «Современные проблемы популяционной экологии» (Белгород, 2006), на межвузовских научных конференциях преподавателей, аспирантов и студентов (Липецк, 2003 – 2006 гг.) и заседаниях Учёного совета ГНУ ВНИПТИР (Липецк, 2004 - 2007 гг.).

На защиту выносятся следующие положения:

1. Экспериментальное обоснование влияния эндогенных и экзогенных факторов на индукцию гаплоидии в культуре неоплодотворенных семязачатков в условиях in vitro, позволяющее ускоренно получать новый исходный материал ярового рапса.

2. Способ создания реституционных линий рапса, основанный на индукции гаплоидии из неоплодотворенных семязачатков, стабилизации, микроразмножении и диплоидизации полученных регенерантов.

3. Параметры эмбриокультуры, заключающиеся в определении влияния направления скрещиваний и оптимизации условий культивирования зародышей отдаленных гибридов.

4. Ценные признаки полученных гибридных растений и реституционных линий.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 128 страницах и состоит из введения, 4 глав, выводов и рекомендаций для практического использования. Работа иллюстрирована 53 рисунками, включая фотоснимки, и содержит 19 таблиц. Библиография включает 222 литературных источника, из которых 135 на иностранных языках.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ, кроме того, 3 работы находятся в печати.

Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории биотехнологии ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свеклы и сахара имени А.Л. Мазлумова».



СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ


Материал, методика и условия проведения опытов



Исходный материал.

Настоящая работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском и проектно-технологическом институте рапса (г. Липецк) в 2003 – 2006 гг. в рамках тематических планов 04.03.04.01.03 «Создать исходный материал для гетерозисной селекции на основе ЦМС с применением метода культуры неоплодотворенных семязачатков рапса» и 04.03.04.01.04 «Создать новый исходный материал от межвидовых и межродовых скрещиваний растений семейства Brassicaceae методом эмбриокультуры». Цитоэмбриологические исследования проводились в лабораторных условиях отдела биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института сахарной свёклы и сахара им. А.Л. Мазлумова (п. Рамонь, Воронежской области).

В качестве исходного материала для индуцирования гаплоидии использовались сорта ярового рапса (Ратник, Липецкий, Hanna, Galaxy), полученные на их основе самоопылённые линии на стерильной цитоплазме и гибриды с генами восстановления фертильности.

С целью получения отдаленных гибридов в полевых и тепличных условиях проводили реципрокные межвидовые скрещивания рапса (Brassica napus L., 2n=38, F5 (Харьковская 6  Hanna)) с горчицей сарептской (B. juncea (L.) Сzern., 2n=36, сорт ВНИИМК 13) и межродовые скрещивания рапса (F3 (6B  (CHk198  L159)  (ВНИИМК 162  ВНИИМК 109)) с горчицей белой (Sinapis alba L., 2n=24, сорт R 166), а также сурепицы яровой (B. campestris L. var. oleifera, 2n=20, сорт Восточная) и декоративной капустой (B. oleracea var. capitata, 2n=18).

Условия и методика проведения опытов.



Индуцирование гаплоидии. Растения ярового рапса выращивались в теплице и на полях ВНИПТИР, расположенных в 10 км к северу от г. Липецка. Семязачатки изолировали из 1-30 бутонов от первого цветка, длиной от 2 до 6 мм, с центральной кисти и побегов первого и второго порядков. Введение в культуру проводилось в летний период с растений, выращенных в поле, в зимне-весенний – с доноров, выращенных в теплице. Закладка опытов, фенологические наблюдения, уход за посевами, гибридизация проводились согласно общепринятым методикам (Пустовойт, 1967).

Для стерилизации бутонов ярового рапса применяли растворы веществ: хлорамин Б и Domestos в различных концентрациях, анолит (рН=6) и смесь анолита с католитом (рН=7 и рН=9). Экспозиция бутонов в исследуемых растворах составляла 10 мин.

Извлечение семязачатков из завязи и введение их в культуру проводили в стерильных условиях пылезащитного бокса под бинокулярным микроскопом МБС-9 (кратность увеличения 12,8). Всего культивировалось более 10 тыс. неоплодотворённых семязачатков.

В исследованиях использовалась общепринятая техника приготовления и стерилизации питательных сред (Бутенко, 1964, 1999). Для культивирования эксплантов применялись среды Мурасиге-Скуга (MS) (Murashige, Skoog, 1962) и Гамборга (В5) (Gamborg, Eveling, 1968). В питательную среду добавляли витамины по Уайту (White, 1963), 100 мг/л мезоинозита, 20-40 г/л сахарозы. Индукция гаплоидных растений достигалась добавлением гормонов: 6-бензиламинопурина (6-БАП), гиббереллина (ГК), кинетина, -нафтилуксус-ной кислоты (НУК), индолилуксусной кислоты (ИУК) в различных концентрациях (0,01 - 3 мг/л) и сочетаниях. рН среды поддерживался на уровне 5,8-6,0. В качестве контроля применяли безгормональную питательную среду.

Обработку материала пониженной температурой (+4-6 оС) при экспозиции 1-3 суток проводили в бытовом холодильнике.

Культивирование неоплодотворённых семязачатков проводили в термальной комнате на свету при 16-часовом фотопериоде и в темноте, при температуре 23 – 26 ºС, освещённости 5 тыс. люкс и влажности воздуха 70 %.

Перевод гаплоидных регенерантов на диплоидный уровень в условиях in vitro проводили на основе безгормональной питательной среды с добавлением 0,005 – 0,01 % водного раствора колхицина в течение 2-х суток в условиях темноты. Затем растения пересаживали на питательную среду, содержащую 0,25 мг/л кинетина и культивировали 1 месяц на свету. Определение уровня плоидности производили методом подсчёта числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц и числа хромосом в точках роста. Хорошо развитые пробирочные растения пересаживали в теплицу в смесь песка и почвы в соотношении 1:3 и накрывали стеклянными стаканчиками для прохождения акклиматизации.

Жирнокислотный состав масла определялся в биохимической лаборатории отдела селекции ВНИПТИР н.с. Германенко Г.В. по методике Демьянчук Г.Т. (1988) методом газожидкостной хроматографии по ГОСТ 30089-93, содержание глюкозинолатов в семенах – экспересс-методом (ГОСТ 9824-87, п. 3.5).



Эмбриокультура. Незрелые зародыши межвидовых и межродовых гибридов вводили в культуру in vitro на разных стадиях развития (5, 7, 10, 13 и 17 дни после опыления). Культивирование зародышей проводили на агаризованной питательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением 30 г/л сахарозы, БАП, ГК по 0,2 мг/л, 0,1 мг/л НУК и 300 мг/л гидролизата казеина.

Морфологическое описание гибридов осуществляли по методике ВИР (Корнейчук, 1983). Для цитологического изучения на всех этапах работы использовались общеизвестные методики (Паушева, 1988). Цитологические препараты просматривали на микроскопах МБИ-6, МБИ-15, Ienaval. Фотографирование препаратов и объектов исследования осуществляли с помощью фотоаппарата Olympus 400 Digital на микроскопах МБИ-15 и Ienaval (окуляр 8-10х, объектив – 12,5-40х).

Повторность опытов двух-трехкратная. При обработке экспериментальных данных использовали однофакторный и двухфакторный дисперсионный анализ (Доспехов, 1985), программы Excel и Statistica v. 6.0.

ИНДУЦИРОВАНИЕ ГАПЛОИДИИ ИЗ НЕОПЛОДОТВОРЁННЫХ СЕМЯЗАЧАТКОВ ЯРОВОГО РАПСА В УСЛОВИЯХ IN VITRO


Влияние эндогенных факторов на индукцию гаплоидии



Влияние генотипа.

Определяющим из комплекса лимитирующих факторов в культуре неоплодотворенных семязачатков являлся генотип растения-донора. Проведенные исследования показали, что реализация морфогенеза происходила по пути гистогенеза и органогенеза, приводящего к формированию ростовых почек и корней.

При введении в культуру семязачатки имели светло-зеленый цвет, затем становились матово-белыми, а в дальнейшем бурыми, и 37 % образовывали каллусы небольшого размера молочного или желтого цвета. При этом обнаруживалось образование двух типов каллусной ткани. Каллус первого типа (неморфогенный) формировался на 10 - 14-й день культивирования и представлял собой водянистую массу клеток рыхлой консистенции и жёлтого или мутно-серого цвета. На таких каллусах наблюдался некроз тканей или ризогенез, и они не были способны к регенерации.

Каллус второго типа (морфогенный) становился визуально заметным на 18 - 20-й день культивирования и имел белую или бледно-жёлтую окраску, плотную консистенцию и зернистую или глобулярную структуру. Массовое формирование и развитие каллуса наблюдали за период с 30-го по 45-й день после изоляции, что согласуется с данными других исследователей (Славова, Рафаилова, 1991). В процессе культивирования в нем образовывались проэмбриогенные массы или меристематические зоны. В дальнейшем из этих меристематических очагов путем последующей дифференциации формировались сначала ростовые почки, а затем растения.

Следует отметить, что в 98 % случаев наблюдался процесс развития вегетативной почки (вегетативный геммогенез). Формирующиеся регенеранты имели слабо развитый гипокотиль с двумя-тремя узкими листовыми пластинками бледно-зеленого цвета. Отмечались единичные случаи генеративного геммогенеза, когда растение высотой не более 2,5 см образовывало бутоны.

Из 16 изученных генотипов ярового рапса 15 были способны к каллусообразованию, 10 обладали способностью к индукции ростовых почек и только у пяти генотипов почки развивались в растения.

Частота индукции каллусных структур колебалась от 0 до 7,10 % в зависимости от генотипа донорского растения. У сортов и самоопыленных линий со стерильной цитоплазмой выявили самую низкую частоту каллусообразования, которая составила 1,15 % и 2,43 %, и регенерации (1,67 % и 3,85 % соответственно). Сорта и линии более чем в 2 раза уступали материалу гибридного происхождения по количеству ростовых почек (12,46 %). Гибриды обладали наибольшей склонностью к индукции каллуса и регенерации проростков, составивших в среднем 3,55 % и 4,72 %. Кроме того, у материала гибридного происхождения были обнаружены максимальные значения частоты образования каллуса (7,1 %) у генотипа № 3, ростовых почек (29,41 %) у № 7 и регенерантов (17,65 %) у № 8 (табл. 1).

Таблица 1 – Влияние генотипа донорского материала на регенерационную способность неоплодотворённых семязачатков ярового рапса (2003 - 2005 гг.)



мате-риала



Характерис-тика материала

Введено семязачатков, шт.

Получено каллусов

Сформировано из каллусов

ростовых

почек


проростков

шт.

%

шт.

%

шт.

%



Гибриды

1055

43

4,08

0

0

0

0



1048

28

2,67

2

7,14

0

0



507

36

7,10

4

11,11

3

8,33



936

28

2,99

3

10,71

0

0



585

8

1,37

1

12,5

0

0



1119

19

1,70

1

5,26

0

0



811

17

2,34

5

29,41

2

11,76



551

34

6,17

8

23,53

6

17,65



Сорта

656

15

2,29

2

13,33

1

6,67



541

6

1,11

0

0

0

0



762

9

1,18

1

11,11

0

0



298

0

0

0

0

0

0



Линии

443

13

2,94

3

23,08

2

15,38



234

2

0,85

0

0

0

0



222

9

4,05

0

0

0

0



375

7

1,87

0

0

0

0

НСР0,05 = 0,03

НСР0,05= 0,25

НСР0,05= 0,23

Максимальную частоту регенерации среди линий наблюдали у № 13 - полученной на основе сорта Hanna самоопыленной линии со стерильной цитоплазмой (15,38 %). Сорт Hanna (№ 10) также проявил способность к индукции морфогенного каллуса и образованию ростовых почек (11,11 %). Наибольшей склонностью к индукции гаплоидии среди сортов ярового рапса обладал № 9 (Липецкий) – 6,67 %.

Часть генотипов (№ 1, 10, 14, 15, 16) формировала нерегенерационный каллус. Многие генотипы, например, № 4, 5, 11, обнаруживали относительно высокий выход ростовых почек (10,71 %, 12,5 % и 11,11 % соответственно), однако, при пересадке их на среду для регенерации дальнейшего развития отмечено не было. Таким образом, у ярового рапса способность к каллусообразованию и регенерации растений в культуре неоплодотворённых семязачатков зависела от генотипа донорского растения.



Маркерные признаки растений-доноров.

Результаты исследований показали, что гетеростилия третьего и четвертого типов и недоразвитость пыльников встречаются у генотипов №№ 3, 7, 8, 13, обладающих лучшей регенерационной способностью в культуре неоплодотворенных семязачатков in vitro. Частота встречаемости аномальных форм цветка колебалась в зависимости от происхождения материала и достигала 73% у линии № 13, в то время как в норме она составляла не более 35,3 %. Кроме того, у гибрида № 8 отмечались случаи срастания соседних цветоножек и уменьшение их длины с 2,1 см до 1,2 см, т.е. почти в 2 раза.

Цитологические наблюдения показали, что данный селекционный материал отличался наличием изменений при формировании мужских гамет. Аномалии проявлялись в формировании микроспор, где были отмечены триады и тетрады с аномальным развитием. Также было отмечено наличие пыльцевых зерен измененной формы и увеличенного размера до 49,5 мкм, что превышало размеры нормальных зерен примерно в 1,5-2 раза.

Проведенные исследования позволили выявить зависимость регенерационной способности селекционного материала от количества аномальных пыльцевых зерен. Так, у гибрида № 3 при наличии 3,5 % аномальных пыльцевых зерен регенерационная способность достигала 8,33 %, а у гибрида № 8 данные показатели составили соответственно 32,9 % и 17,65 % (рис. 1).

Рис. 1. Зависимость регенерационной способности от количества нарушений при формировании мужских гамет у растений-доноров

Следовательно, морфологические изменения формы цветка и генеративных органов, а также качественные признаки пыльцевых зерен и микроспор можно использовать как маркерные признаки при отборе донорских генотипов для индуцирования гаплоидов.

Зависимость регенерационной способности семязачатков от длины бутонов и расположения ветвей на побеге.

Другим существенным фактором, влияющим на регенерационную способность неоплодотворенных семязачатков является стадия развития зародышевого мешка при введении эксплантатов. Анализ полученных результатов показал, что морфогенетическому развитию в большей степени подвержены семязачатки, изолированные из бутонов длиной 2,0 - 4,0 мм, частота образования каллуса у которых составляла 3,3 %, а выход регенерантов колебался от 0,3 до 0,7 %.

Результаты исследований показали, что семязачатки из бутонов с центральной кисти обладали максимальной способностью к каллусообразованию (5,7 %) и регенерации (1,3 %). Экспланты из бутонов с ветвей первого порядка, образовывали в два раза меньше каллусных структур (2,6 %) и регенерантов (0,7 %), а бутоны с побегов второго порядка практически не были способны к регенерации. Возможно, полученные результаты связаны с повышенной активностью всех физиологических процессов, происходящих в основных побегах ярового рапса.

Таким образом, наибольшей способностью к индукции новообразований обладают семязачатки, эксплантированные с бутонов центральной кисти основного побега ярового рапса длиной 2 - 4 мм. Данные наблюдения следует использовать при введении в культуру эксплантов с большей регенерационной способностью.

Влияние экзогенных факторов на индукцию гаплоидии



Подбор оптимального стерилизующего агента.

Результаты сравнения действия различных стерилизующих агентов показали, что использование 10 %-х растворов хлорамина и Domestos обеспечивало 100 % стерильность материала. Однако, при этом отмечено угнетение развития регенерантов. Наибольшее число регенерантов (8,0 %) и их нормальное развитие наблюдали при стерилизации 7 %-ным раствором Domestos (табл. 2).

Таблица 2 – Эффективность стерилизации бутонов различными дезинфицирующими веществами при введении неоплодотворённых семязачатков ярового рапса в культуру in vitro (2004-2005 гг.)



Дезинфици-рующий

раствор


Концент-рация раствора, %

Введено в культуру семяза-чатков, шт.

Инфицировано семязачатков, %

Получено регене-рантов,

%


Развитие регене-рантов (по 5-бальной шкале)

гриб-ной

инфек-цией



бактерии-альной

инфекцией



Хлорамин

7

123

9,8

21,1

0,8

3

10

119

0

0

2,5

3

Domestos

5

120

0

12,5

4,2

3

7

125

0

0

8,0

5

10

198

0

0

5,1

4

Анолит

рН=6

118

0

0

12,7

5

Анолит+

католит


рН=7

200

0

0

21,0

5

рН=9

124

0

0

14,5

5

Итого:

1278

0,9

6,9

8,1




Выявлено, что количество семязачатков, поражённых бактериальной инфекцией, составило 6,9 % против 0,9 % эксплантов, подверженных воздействию грибной инфекцией.

Обработка бутонов ярового рапса раствором анолита и смесью анолита с католитом не только уничтожила инфекцию, но и стимулировала развитие семязачатков. При стерилизации бутонов смесью анолита с католитом (рН=7) у каллусов получили максимальное количество регенерантов - 21,0 %. При этом образование каллуса и ростовых почек наблюдалось на 7 - 10 дней раньше, чем при использовании других дезинфицирующих веществ, что согласуется с отмеченным другими исследователями благоприятным влиянием на растения активированной воды (Васильченко, 2005).

Таким образом, при культивировании неоплодотворённых семязачатков in vitro наряду с 7 %-ным раствором Domestos эффективными дезинфицирующими агентами являются экологически чистые электроактивированные водные растворы анолит и смесь анолита с католитом (рН=7), ускоряющие развитие неоплодотворённых семязачатков ярового рапса в культуре in vitro.

Влияние сроков введения в культуру и предобработки бутонов на индукцию гаплоидии. При изучении регенерационной способности неоплодотворенных семязачатков ярового рапса, выращенного в условиях теплицы и поля, выявлено, что количество каллусных структур в 2004 - 2005 гг. колебалось от 5, 6 % до 0,58 % при введении эксплантов с донорских растений, вегетировавших в поле. Условия теплицы были более стабильными, в связи с чем и частота каллусообразования колебалась незначительно и составляла в среднем 2,34 %.

Наибольшее количество проростков (0,26 %) было получено в 2004 г. при эксплантации семязачатков с растений, При зимне-весенней эксплантации частота образования проростков была меньше и составляла 0,03 %, в 2005 г. - 0,19 %.

Экспериментальные данные по обработке неоплодотворённых семязачатков холодом в течение 24 часов показали максимальную склонность эксплантов к образованию каллусов – до 61,1 % и наибольшее количество регенерантов (3,1 %). Частота регенерации находилась в прямой зависимости от экспозиции обработки и понижалась с 3,1 % (1 день) до 0,8 % (3 день воздействия). Следовательно, обработка холодом в течение суток повышала морфогенную способность семязачатков.

Зависимость регенерационной способности неоплодотворённых семязачатков от условий культивирования.

Еще одним экзогенным фактором, от которого зависит эффективность получения гаплоидных растений в культуре in vitro, является состав питательной среды.

Максимальная частота каллусообразования (5,7 %) была получена при добавлении в питательную среду 20 % сахарозы. Увеличение концентрации сахарозы до 30 г/л снижало частоту каллусообразования до 1,2 %, а наличие в питательной среде 40 г/л сахарозы оказывало ингибирующий эффект, что согласуется с данными других исследователей (Zhou, Yang, 1981).

При изучении влияния минерального состава среды на регуляцию роста и развития культивируемых семязачатков ярового рапса не было выявлено достоверных различий по частоте каллусообразования на средах с минеральной основой В5 и MS при 5 %-ном уровне значимости по результатам дисперсионного анализа двухфакторного опыта (рис. 3).

Рис. 3. Действие гормональных добавок на частоту каллусообразования в

зависимости от минерального состава среды

В результате исследований было выявлено, что наибольшая частота образования каллуса (5,81 %) и достоверные различия по сравнению с контролем наблюдались в варианте № 5 питательной среды MS с добавлением 0,3 мг/л 6-БАП, 0,01 мг/л ИУК и 0,3 мг/л ГК. На остальных вариантах сред частота каллусообразования существенно не превышала стандарт и находилась на одном с ним уровне. В связи с этим в дальнейших исследованиях применялась среда с минеральной основой MS.

Изучение гормонального состава питательной среды показало, что наибольшая способность к каллусообразованию (15 %) и достоверные различия по сравнению с контролем наблюдались в варианте № 21 питательной среды (табл. 3).

Таблица 3 – Влияние ростовых веществ в питательной среде на каллусогенез ярового рапса в культуре неоплодотворённых семязачатков (2004 – 2005 гг.)


Вариант сред

Соотношение

БАП:кин:ИУК:ГК:гидр.каз.:2,4-Д

Введено семязачатков, шт.

Образование каллуса


шт.

%

1.(st)

Без гормонов

561

2

0,36

13

1: 0,1 : 0 : 0,5 : 0 : 0

300

1

0,33

14

2: 0,1 : 0 : 0,5 : 0 : 0

300

0

0

15

3 : 0,1 : 0 : 0,5 : 0 : 0

300

0

0

16

1 : 0,1 : 0,01 : 0,5 : 0 : 0

300

16

5,33

17

2 : 0,1 : 0,01 : 0,5 : 0 : 0

300

9

3,00

18

3 : 0,1 : 0,01 : 0,5 : 0 : 0

300

4

1,33

19

0,5 : 0,1 : 0,1 : 0 : 100 : 0

200

2

1,00

20

0,5 : 0,1 : 0,1 : 0 : 300 : 0

240

2

0,83

21

0 : 1 : 0,1 : 1 : 10 : 0

200

30

15,00

22

0 : 1 : 0,1 : 1 : 0 : 0

140

10

7,14

23

0,5 : 1 : 0,5 : 0,5 : 0 : 0,5

215

3

1,40

24

1 : 0,5 : 1 : 1 : 0 : 1

244

2

0,82

25

0,5 : 1 : 0,5 : 0,5 : 0 : 0,1

680

28

4,12

26

0 : 1 : 0,1 : 0,5 : 0 : 0,5

275

5

1,82

НСР0,05=4,03

Только морфогенные каллусы, образовавшиеся на средах № 16 и 23 – 26 обладали способностью к формированию ростовых почек. Максимальное количество ростовых почек (71,4 %) формировалось на питательной среде (вариант № 25) с превышением концентраций цитокининов по отношению к ауксинам более, чем в 2 раза (1,5 : 0,6).

Оптимальной для индукции проростков оказалась среда № 25, частота регенерации на которой составила 58,8 % (табл. 4).

Таблица 4 – Формирование регенерантов из каллусных структур в зависимости от состава питательной среды (2004 – 2006 гг.)



Вариант среды, №

Число каллусных образований, шт.

Получено

Характеристика

состояния



ростовых

почек


регенерантов из ростовых почек

шт.

%

шт.

%

1.(st)

2

0

0

0

0

-

16

16

5

31,3

0

0

Бесцветные почки, нет развития

23

3

2

66,7

1

50,0

Проростки с листьями

24

2

1

50,0

1

100,0

Витрифицированные проростки с широкими листьями и утолщенным стеблем

25

28

20

71,4

11

58,8

Нормально развивающиеся проростки с листьями

26

5

2

40,0

1

50,0

Итого:

54

30

64,5

14

25,0

-

Бóльшее количество кинетина и меньшая концентрация 6-БАП (превосходящего кинетин по активности) в составе данной среды способствовало росту регенерантов и их нормальному развитию из ростовых почек.

При пересадке на среду для регенерации не все ростовые почки, полученные в культуре неоплодотворенных семязачатков, развивались в растения. Частота регенерации широко варьировала в зависимости от генотипа и составляла от 0 до 100 %.

Регенеранты с признаками обводнения погибали в течение 2-х недель от появления проростка. Больше 50 % растений с изменённым морфотипом обладало способностью к образованию вторичных регенерантов на разросшихся тканях гипокотиля. Ростовые почки формировались в количестве от 1 до 7 на первичный регенерант. При пересадке вторичных регенерантов на безгормональную среду В5 они развивались в нормальные растения.

При изучении светового режима культивирования эксплантов выявлено, что в темновых условиях активнее, чем на свету проходило формирование каллусов - 59,5 % и 44,3 % соответственно. Однако при этом наблюдалось угнетение развивающихся эксплантов, а количество регенерантов сокращалось в 2,2 раза, что составляло 1,0 %.

Таким образом, процесс воспроизведения гаплоидных растений в условиях in vitro определяется прежде всего на генетическом уровне, но реализуется в зависимости от конкретных физиологических условий и различных по действию индуцирующих факторов.

ГАПЛОИДИЯ КАК УСКОРЕННЫЙ МЕТОД СОЗДАНИЯ ГОМОЗИГОТНЫХ ЛИНИЙ ЯРОВОГО РАПСА



Формирование гаплоидных линий.

Исследования показали, что на начальных стадиях роста гаплоидные регенеранты отличались слабым развитием и жизнеспособностью вследствие одинарного набора хромосом. Гибель регенерантов на этой стадии составляла в зависимости от генотипа растений-доноров до 62 %.

Культивирование гаплоидных проростков с признаками витрификации на средах с гормонами не приводило к формированию нормальных растений, а чаще всего влекло за собой их гибель. Для формирования гаплоидных линий многими исследователями было предложено проведение этапа стабилизации, (Таратонов, 1999). Согласно нашим исследованиям, использование чередования гормональной и безгормональной сред позволяло регенерантам приобрести способность образовывать пазушные побеги, благодаря чему количество регенерантов гибрида № 3 увеличилось от 3 до 32 растений к 4 пассажу.

Установлено, что для нормально развитых гаплоидных растений этап стабилизации заключался в чередовании следующих сред: гормональная – безгормональная – гормональная. Для слабо развитых или витрифицированных адвентивных побегов необходимо сначала культивирование на безгормональной среде, а затем на гормональной.

Доказательством стабилизации и выравненности гомозиготных линий является анализ плоидности. У каждого из полученных регенерантов в 100 клетках была определена длина замыкающих клеток устьиц и подсчитано число хлоропластов в них. Установлено различие в размерах замыкающих устьичных клеток у растений с разным уровнем плоидности. Отношение длины замыкающих клеток устьиц листа гаплоидов к клеткам ди- и триплоидной форм составило 1 : 1,58 и 1 : 2,21 соответственно.

В результате подсчёта числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц выявлено, что у гаплоидных растений встречалось от 8 до 11 хлоропластов на две замыкающие клетки устьица, у диплоидных – от 12 до 14. У триплоидных форм отмечалось более 14 хлоропластов (табл. 5).

Таблица 5 –Число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц листа и длина клеток у растений ярового рапса при различных уровнях плоидности



Уровень плоидности

Количество хлоропластов, шт.

Длина замыкающих

устьичных клеток, мкм



Среднее

значение


Мини-максимальные средние

Гаплоидный (n)

9,8 ± 1,45

8,3 - 11,2

14,6 ± 1,12

Диплоидный (2n)

13,0 ± 1,05

11,9 - 14,0

23,1 ± 1,87

Триплоидный (3n)

15,2 ± 1,10

14,1 - 16,2

32,2 ± 1,65

Кроме того, у гаплоидных растений наблюдалось возникновение деформированных устьичных клеток и отсутствие в них хлоропластов.

Данные признаки можно использовать в качестве морфологических маркеров для отбора гаплоидных регенерантов на самых ранних этапах развития, когда анализ хромосомного набора крайне затруднителен.



Диплоидизация гаплоидов и формирование реституционных линий.

Для создания гомозиготных линий, способных участвовать в селекционном процессе, гаплоидные растения необходимо перевести на более высокий уровень плоидности. В связи с этим изучалась возможность колхицинирования в культуре in vitro.

Исследования показали, что выживаемость регенерантов, подвергнутых воздействию колхицином в зависимости от генотипа составляла от 50 % до 100 %. Для предотворащения возврата регенерантов на гаплоидный уровень их культивировали на среде с кинетином. Наиболее развитые диплоидные растения размножали на среде с БАП, кинетином и гиббереллином до необходимого количества и укореняли на среде с 1 мг/л НУК. Процесс корнеобразования длился 2-4 недели, при этом частота формирования корней зависела от генотипа и колебалась в пределах 35,6 - 97,4 %. Затем растения переносили в грунт теплицы или в полевые условия.

В результате проведенных нами исследований был разработан метод получения гомозиготных линий ярового рапса на основе индуцирования гаплоидии в культуре неоплодотворенных семязачатков, заключающийся во введении неоплодотворенных семязачатков в культуру, формировании каллуса и регенерации на нем ростовых почек, стабилизации и микроразмножении гаплоидов, их колхицинировании in vitro (диплоидизации); стабилизации, микроразмножении полигаплоидов и корнеобразовании; пересадке в грунт теплицы, акклиматизации и высадке в полевые условия.

Способ получения восстановителей фертильности ярового рапса.

В результате применения метода культуры неоплодотворенных семязачатков было получено 5 реституционных линий, в том числе линии РЛ 7 и РЛ 8, донорские растения которых имели стерильную цитоплазму типа Polima и гены восстановления фертильности. В условиях теплицы и поля полученные растения цвели, и после опыления пыльцой линии РЛ 8 формы, обладающей цитоплазматической мужской стерильностью, завязались семена. Эффективность гибридизации при этом достигала 65,3 %.

Семена реституционных линий были высеяны в теплице, и у растений в период цветения проведен анализ фертильности. Установлено, что фертильность донорского растения № 8 повысилась в результате индуцирования гаплоидии в культуре неоплодотворенных семязачатков in vitro с 78,7 % до 94,5 %, что свидетельствует о том, что линия РЛ 8 может быть использована в качестве восстановителя фертильности в гетерозисной селекции ярового рапса.

Полученные данные позволили разработать способ получения восстановителей фертильности рапса, состоящий из следующих этапов:

1.

Получение гомозиготных линий ярового рапса от исходных форм, обладающих свойством восстановления фертильности, с помощью индуцирования гаплоидии посредством культуры неоплодотворенных семязачатков in vitro.

2.

Посев семян полученных реституционных линий в поле и обычный уход за растениями.

3.

Опыление форм с цитоплазматической мужской стерильностью пыльцой реституционных линий.

4.

Посев полученных семян в поле и анализ фертильности пыльцевых зерен.

Характеристика полученных реституционных линий

Каждую линию по средним значениям показателей в зависимости от того, насколько они превышают значения донорских растений, оценивали по пятибалльной системе. В результате выявили, что по всем исследованным элементам структуры урожая выделилась линия РЛ 8 с максимальным количеством баллов (44). Минимальную оценку получила РЛ 7 (29 баллов), значения которой резко колебались по разным показателям.

Сравнение реституционных линий, полученных в культуре неоплодотворенных семязачатков, с донорами по элементам структуры урожая показало уменьшение высоты полученных растений примерно в 1,5 раза, повышающее устойчивость растений к полеганию с 3 до 5 баллов.

Кроме того, у полученных линий ярового рапса интерес представляло изучение качества масла и семян. Основным требованием, предъявляемым к современным сортам, принимаемым в производство пищевого рапсового масла, является содержание менее 0,6 % глюкозинолатов в семенах и снижение практически до нуля эруковой кислоты в масле.

Биохимический анализ семян полученных линий выявил, что у трех из пяти линий (РЛ 3, РЛ 8, РЛ 9) содержание глюкозинолатов не превышает 0,6 %. При этом две из них (РЛ 3, РЛ 8) являются и низкоглюкозинолатными, и безэруковыми, т.е. принадлежат к «00» типу и имеют увеличенное содержание линолевой кислоты (23,7 и 20, 0 % соответственно) по сравнению со стандартом (18,5 %) и пониженное содержание линоленовой кислоты по сравнению с сортом–стандартом Ратник (9,4 %) - 8,4 и 8,1% соответственно. Помимо этого, у данных линий суммарное содержание олеиновой и линолевой кислот составляет более 80,0 %, что представляет большой интерес для селекции на качество пищевого масла. Кроме того, линия РЛ 8 отличалась повышением содержания олеиновой кислоты по сравнению с гибридом-донором с 63,1 % до 66,0 %.

Линия ГЛ 9 с содержанием эруковой кислоты 39,9 % может быть рекомендована в качестве исходного материала для селекции высокоэруковых сортов рапса для производства биотоплива, где высокое содержание эруковой кислоты важно для устойчивости топливной смеси к окислению (Дубовская и др., 2005).

Таким образом, полученные линии являются перспективным исходным материалом для создания высокопродуктивных линейных сортов типа «00», а также для использования в гетерозисной селекции.

ЭМБРИОКУЛЬТУРА В УСЛОВИЯХ IN VITRO


Влияние направления скрещивания на выживаемость гибридных зародышей в условиях in vitro

Основной задачей межвидовых и межродовых скрещиваний являлся перенос рапсу признаков крупности семян и желтой окраски семенной оболочки, а также устойчивости к альтернариозу.

Получение истинных межродовых гибридов горчицы белой с рапсом в полевых условиях затруднено. Проведенные исследования показали, что эффективность гибридизации находилась на низком уровне и достигала 1,2 % в прямом и 0,2 % в обратном скрещивании. Предполагается, что низкая завязываемость семян обусловлена несовместимостью пыльцы и рылец (Ripley, Arnison, 1990). Применяя культуру незрелых зародышей, удалось получить гибридные проростки (1,9 %) при использовании рапса в качестве материнской формы, в обратных скрещиваниях регенерация гибридных зародышей не отмечалась. Морфогенез осуществлялся через прямую регенерацию, ведущую к формированию ростовых побегов.

Скрещивания рапса ярового с горчицей сарептской в полевых условиях проходили более успешно, но эффективность гибридизации находилась на невысоком уровне – 5,6 % и 1,7 % в обратных скрещиваниях.

Увеличить жизнеспособность зародышей в 1,8 раза в прямом и в 2,9 раза в обратном скрещивании удалось с применением эмбриокультуры. При использовании рапса в качестве отцовского компонента скрещивания средняя частота образования проростков (16,4 %) была в 5,3 раза больше, чем в прямых скрещиваниях (3,1 %). Кроме того, в обратных скрещиваниях было получено 33,3 % растений с гибридным морфотипом, что составило 4 растения из 12.

Таким образом, в скрещиваниях рапса с горчицей белой наиболее эффективным оказалось культивирование гибридных зародышей от прямых скрещиваний, а с горчицей сарептской – от обратных скрещиваний.


Влияние возраста зародышей и условий культивирования на процесс



регенерации

Результаты проведенных исследований показали, что на развитие незрелых зародышей в культуре in vitro оказывает влияние целый комплекс лимитирующих факторов, одним из которых является возраст эксплантов. Недифференцированные гибридные 5-дневные зародыши (ранняя глобулярная стадия) не прорастали на питательной среде ни в одной из комбинаций скрещивания. Наиболее эффективным было введение в культуру недоразвитых зародышей на 10 - 17 дни после опыления.

Для скрещиваний B. napus × B. juncea наибольшее количество регенерантов было получено при эксплантировании зародышей через 13 дней после опыления (25 %). В остальных комбинациях скрещивания у зародышей, изолированных на 17 день после опыления, наблюдалась наибольшая частота регенерации как в скрещиваниях рапса ярового с горчицей белой (3,5 %), так и с горчицей сарептской (54,5 %) (рис. 4).

Количество дней после опыления


Рис. 4. Влияние возраста зародышей на их жизнеспособность в условиях

in vitro (2005-2006 гг.)
Максимальная частота регенерации (60 %) была получена у зародышей того же возраста от скрещивания сурепицы яровой и капусты. Данные скрещивания, как и предыдущие, также применялись для получения желтосемянных форм рапса посредством его ресинтеза и увеличения генетического разнообразия внутри рода Brassica. Применение эмбриокультуры в данном случае увеличило жизнеспособность гибридных зародышей, так как эффективность гибридизации была небольшой и составляла всего 3,5 %. Следовательно, на развитие оплодотворенных семязачатков в культуре in vitro большое влияние оказывал возраст экспланта.

При изучении состава питательной среды было установлено, что большое количество цитокининов в варианте среды № 2 (6-БАП - 0,3 мг/л, кинетин -0,1 мг/л) снижало частоту регенерации до 1,1 % и количество нормально развитых проростков – до 0,7 %.

Добавление НУК и ГК стимулировало регенерацию 4,5 % зародышей. Уменьшение концентрации 6-БАП с 0,3 до 0,2 мг/л и увеличение концентрации ГК до 0,2 мг/л позволило получить максимальное количество нормально развитых проростков (12,0 %). Оптимальным являлось содержание в составе среды 0,2 мг/л 6-БАП, 0,1 мг/л НУК и 0,2 мг/л ГК.

Определение светового режима показало, что незрелые зародыши в условиях культуры тканей развивались как в темноте, так и на свету. При относительно равном количестве общего числа полученных проростков (4,0 % и 4,2 % соответственно) образование нормально развитых регенерантов повышалось с 1,3 % в условиях темноты до 3,7 % на световом режиме. Проростки затем проходили этап микроразмножения, укоренения и пересадки в грунт.


Характеристика полученных гибридов



Гибриды рапса ярового и горчицы сарептской. В результате исследований было получено 16 растений, большинство из которых (69 %) имели морфологические признаки материнской формы. Как в условиях in vitro в фазе 2-3 листьев, так и взрослые растения не отличались от горчицы сарептской по окраске, волнистости и зубчатости края листа, его положению на стебле, наличию опушенности и другим признакам.

Гибриды сурепицы яровой и капусты. Растения, полученные в результате ресинтеза, принадлежали либо к материнскому, либо к промежуточному морфотипу. У гибридов доминировали такие признаки отцовской формы, как гофрированность, толщина и темно-зеленая окраска листовой пластинки. Было получено два растения, которые образовали семена, 78 % которых были невыполненными, а остальные нормальные семена имели коричневую окраску.

Гибриды рапса ярового и горчицы белой. Гибридные растения на стадии 2-3 листьев по некоторым морфологическим признакам были аналогичны горчице (отцовской форме): имели сильное опушение, среднюю степень антоциановой окраски семядолей. Данные результаты подтверждают истинность полученных гибридов.

Проведенное в полевых условиях морфологическое описание гибридов F1 горчицы белой и рапса ярового показало промежуточное наследование некоторых признаков (число долей, волнистость и зубчатость края листа изгиб верхушки листа, опушенность края первого листа). Полученные гибриды отличались большим числом ветвей первого порядка (до 12 шт.) и обильным цветением. При их скрещивании с яровым рапсом наблюдалось завязывание семян и образование стручков с промежуточной между родительскими формами длиной створки (табл. 6).


Таблица 6 – Промежуточное наследование некоторых признаков гибридов F1 горчицы белой и рапса ярового

Признаки

Brassica napus

Brassica napus × Sinapis alba

Sinapis alba

НСР0,05

1. Семядоли:

- длина, мм

- ширина, мм

6,9 ± 0,27

13,8 ± 0,41



7,2 ± 0,13

15,9 ± 0,74



7,6 ± 0,71

18,1 ± 0,33



0,69

0,81


2. Морфология листа:

- число долей

- опушенность края первого листа

- характер изгиба верхушки


4,5 ± 0,65

редкая
средний

4,9 ± 0,73

средняя
слабый

5,8 ± 0,17

густая
отсутствует


0,34

-
-


3. Опушенность стебля

отсутствует

слабая

сильная

-

4. Высота ветвления, см

47,3 ± 1,93

40,0 ± 1,13

35,4 ± 1,65

1,89

5. Длина створки стручка, мм

54,1 ± 0,29

17,6 ± 0,67

14,7 ± 0,65

1,31

Среди полученных гибридов рапса ярового и горчицы белой выявлены образцы (28 %), устойчивые к тле, на которых отмечалась наименьшая плотность заселения растений (1 балл, менее 25 % поверхности листьев) наряду с растениями горчицы белой. На остальных экземплярах в зависимости от генотипа данный показатель колебался от 26—50 % (2 балла) до более 50 % (3 балла) заселенности всей поверхности листьев тлей. Предполагается, что устойчивость к тле связана с опушением гибридов, которое они унаследовали от отцовской формы (горчицы белой).

У 82,3 % гибридных семян отмечалась желтая семенная оболочка, причем среди желтоокрашенных семян были чисто желтые, с темным рубчиком и крапинками. Расщепление по окраске гибридов F1 объясняется тем, что желтую окраску семян определяет гомозиготное рецессивное состояние аллелей трех локусов, а исходные растения желтосемянного рапса, участвующего в скрещиваниях, имели сложную гибридную природу с участием ресинтезированных форм. Необходим отбор в последующих поколениях чистых желтоокрашенных семян, дающих полностью светлосемянное потомство. Таким образом, полученный в результате проведенных исследований гибридный материал требует дальнейшего изучения и использования в селекционном процессе.

ВЫВОДЫ

1. Выявлено, что генотип растения-донора определяет cпособность неоплодотворенных семязачатков ярового рапса к дальнейшему развитию. Более отзывчивы к индуцированию гаплоидов материалы гибридного и линейного происхождения (в среднем 4,72 и 3,85 %) по сравнению с сортами (1,67 %).

Морфологические изменения формы цветка и наличие аномальных структур при формировании мужского гаметофита можно использовать как маркерные признаки при отборе донорских генотипов. Установлена прямая зависимость регенерационной способности селекционного материала от количества аномальных структур. Наибольшей способностью к регенерации (1,3 %) обладают семязачатки, эксплантированные с бутонов центральной кисти основного побега ярового рапса длиной 2 - 4 мм.

2. Показано, что смесь анолита с католитом (рН=7) ускоряет развитие неоплодотворённых семязачатков ярового рапса в культуре in vitro на 7 - 10 дней. Предобработка бутонов холодом в течение суток повышает морфогенную способность семязачатков до 3,1 %.

3. Гормональный состав питательных сред определяет пути морфогенеза женского гаметофита и образование морфологических структур при культивировании неоплодотворенных семязачатков ярового рапса. Установлено, что тотипотентность клеток каллуса различается, и реализация морфогенеза происходит по пути гистогенеза и органогенеза, приводящего к формированию ростовых почек и корней.

Максимальный выход морфогенного каллуса достигается путём культивирования неоплодотворенных семязачатков ярового рапса на среде, содержащей 1 мг/л кинетина, 0,1 мг/л ИУК, 1 мг/л ГК и 10 мг/л гидролизата казеина. Наличие в среде 0,1 мг/л 2,4-Д, 0,5 мг/л БАП, ИУК, ГК и 1 мг/л кинетина способствует образованию максимального количества ростовых почек (71,4 %) и регенерантов (58,8 %). Культивирование неоплодотворённых семязачатков на свету более чем в 2 раза по сравнению с условиями темноты стимулирует появление проростков.

4. Определены параметры стабилизации гаплоидных форм в зависимости от морфологического развития регенерантов. Стабилизацию гаплоидов проводят одновременно с микроразмножением в течение 3-4 пассажей с чередованием ростовой (ГК, кинетин, 6-БАП по 0,2 мг/л) – безгормональной – ростовой сред для нормально развитых регенерантов, и безгормональной – ростовой – безгормональной для слабо развитых регенерантов.

Диплоидизация гаплоидного материала осуществляется путём добавления в питательную среду 0,005 % колхицина и выдержке на ней эксплантов в течение 48 часов при последующем культивировании на питательной среде, содержащей 0,25 мг/л кинетина в течение месяца.

5. Разработан метод ускоренного получения гомозиготных линий ярового рапса путем индукции гаплоидии из неоплодотворенных семязачатков, включающий следующие этапы: введение в культуру донорского материала с ценными признаками; индукция гаплоидии; стабилизация и микроразмножение гаплоидов; диплоидизация и стабилизация реституционных диплоидов; микроразмножение; корнеобразование in vitro и пересадка в грунт.

6. На основе данного метода создан способ получения восстановителей фертильности ярового рапса, при котором проводят гибридизацию реституционных линий с растениями-донорами для преодоления стерильности, получение семян второго поколения гомозиготных линий, опыление форм с ЦМС пыльцой полученных реституционных линий, получение семян, их посев и анализ фертильности пыльцевых зерен.

7. В культуре незрелых зародышей морфогенез осуществляется через прямую регенерацию, ведущую к формированию ростовых побегов. Установлены основные параметры культивирования незрелых зародышей. Лимитирующими факторами, обеспечивающими максимальный уровень регенерации, являются подбор донорских растений с ценными признаками, выбор оптимального направления скрещивания, 13-17-дневный возраст зародыша, культивирование на среде, содержащей 0,2 мг/л 6-БАП, 0,1 мг/л НУК и 0,2 мг/л ГК.

8. Среди полученного в ходе применения эмбриокультуры гибридного материала выделены образцы, устойчивые к тле и с желтой семенной оболочкой, которые могут использоваться в селекции ярового рапса.


РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

1. Разработанный метод получения реституционных линий ярового рапса рекомендуется широко использовать в селекции для создания нового исходного гомозиготного материала. В течение 1 - 1,5 лет он может обеспечить получение необходимого объема исходных форм ярового рапса с материнской цитоплазмой. Полученные в результате исследований линии рекомендуются для включения в селекционный процесс.

2. Разработанный способ ускоренного получения восстановителей фертильности ярового рапса рекомендовать для использования в гетерозисной селекции ярового рапса.

3. Установленные параметры культивирования незрелых зародышей, позволяющие расширить генетическую изменчивость и создать новый исходный материал с желтой семенной оболочкой, следует использовать в отдаленной гибридизации ярового рапса.



4. При разработке новых селекционных программ по ускоренному созданию нового исходного материала и высокопродуктивных гибридов рекомендуется применение разработанных для ярового рапса методов биотехнологии: эмбриокультуры и получения гомозиготных линий путем культивирования неоплодотворенных семязачатков.
Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Котлярова Е.Б. Каллусогенез в культуре неоплодотворённых семяпочек ярового рапса / Е.Б. Котлярова, О.А. Подвигина // Вопросы естествознания: Межвузовский сборник научных работ. - Липецк, 2004. - Вып. 12. - С. 31-34.

  2. Котлярова Е.Б. Использование метода эмбриокультуры в отдалённой гибридизации растений семейства Brassicaceae / Е.Б. Котлярова // Сборник научных трудов аспирантов и соискателей. – Липецк: ЛГПУ, 2005. - Ч. 1. – С. 134-136.

  3. Котлярова Е.Б. Культура неоплодотворённых семяпочек ярового рапса in vitro / Е.Б. Котлярова // Актуальные вопросы селекции, технологии и переработки масличных культур: Материалы III Международной конференции молодых ученых и специалистов (28-30 марта 2005 года). - Краснодар, ВНИИМК, 2005. – С. 151-157.

  4. Котлярова Е.Б. Влияние генотипа на каллусогенез и регенерацию растений в культуре неоплодотворённых семяпочек ярового рапса / Е.Б. Котлярова // Экологическая генетика культурных растений: Материалы школы молодых учёных.- Краснодар: РАСХН, ВНИИ риса, 2005. – С. 241-242.

  5. Котлярова Е.Б. Зависимость каллусогенеза и регенерации растений ярового рапса от состава питательной среды в культуре неоплодотворённых семяпочек in vitro / Е.Б. Котлярова, О.А. Подвигина, В.А, Никоноренков // Рапс - культура XXI века: аспекты использования на продовольственные, кормовые и энергетические цели: Материалы Международной научно-практической конференции (15-16 июля 2005 года). – Липецк, ВНИПТИР, 2005. - С. 128-134.

  6. Котлярова Е.Б. Сравнение действия стерилизующих агентов в культуре неоплодотворённых семяпочек ярового рапса in vitro / Е.Б. Котлярова, О.А. Подвигина // Вопросы естествознания: Межвузовский сборник научных работ. - Липецк, 2005. - Вып. 13. - С. 44-46.

  7. Котлярова Е.Б. Влияние направления скрещивания и сроков введения в культуру на развитие зародышей отдалённых гибридов семейства Brassicaceae / Е.Б. Котлярова // Проблемы преподавания молекулярной биологии, биотехнологии и вирусологи в высших педагогических учебных заведениях: Материалы Всероссийской научно-практической конференции (26-27 января 2006 года). – Орехово-Зуево, 2006. – С. 129-133.

  8. Котлярова Е.Б. Возможность создания гомозиготного материала ярового рапса в культуре неоплодотворённых семяпочек / Е.Б Котлярова // Проблемы биологии, экологии и образования: история и современность: Материалы Международной научной конференции (22-24 мая 2006 года). – С.-Пб., 2006. – С. 70-72.

  9. Котлярова Е.Б. Условия культивирования неоплодотворенных семяпочек ярового рапса (Brassica napus L.) для получения гаплоидных растений / Е.Б. Котлярова, О.А. Подвигина // Материалы IХ Международной конференции молодых ботаников (21-26 мая 2006 года). – С.-Пб., 2006. – С. 368.

  10. Котлярова Е.Б. Получение отдаленных гибридов семейства Brassicaceae с помощью эмбриокультуры / Е.Б. Котлярова, Е.Н. Жидкова // Современные проблемы популяционной экологии: Материалы IX Международной научно-практической экологической конференции (2-5 октября 2006 года). – Белгород, 2006. – С. 67-68.

  11. Котлярова Е.Б. Воздействие экзогенных факторов на индукцию гаплоидных растений ярового рапса в условиях in vitro / Е.Б. Котлярова // Вопросы естествознания: Межвузовский сборник научных работ. – Липецк, 2007. - Вып. 14. - С. 78-83.

  12. Котлярова Е.Б. Метод создания гомозиготных линий ярового рапса путем индуцирования гаплоидии в культуре неоплодотворенных семязачатков / Е.Б. Котлярова // Актуальные вопросы селекции, технологии и переработки масличных культур: Материалы III Международной конференции молодых ученых и специалистов (27-29 марта 2007 года). - Краснодар, ВНИИМК, 2007. – С. – 138-141.

  13. Котлярова Е.Б. Формирование линий с помощью культуры неоплодотворенных семязачатков ярового рапса и их биохимическое изучение / Е.Б. Котлярова, В.В. Карпачев // Кормопроизводство. – 2007. - № 4. – С. 17-19.


Е.Б. Котлярова



АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДОВ БИОТЕХНОЛОГИИ



В СЕЛЕКЦИИ ЯРОВОГО РАПСА (BRASSICA NAPUS L.)

Подписано в печать 20.03.2007 г.

Формат 60х84 1/16. Бумага офсетная.

Усл. печ. л. – 1. Тираж 100 экз.

Заказ № 350.

Отпечатано в РИЦ ЛГПУ






novosti-pensionnoj-otrasli-monitoring-smi-rf-po-pensionnoj-tematike-2-fevralya-2011-goda.html
novosti-pensionnoj-otrasli-monitoring-smi-rf-po-pensionnoj-tematike-20-iyunya-2013-goda.html
novosti-pensionnoj-otrasli-monitoring-smi-rf-po-pensionnoj-tematike-20-maya-2013-goda.html
novosti-pensionnoj-otrasli-monitoring-smi-rf-po-pensionnoj-tematike-20-sentyabrya-2011-goda.html
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат