Методические у каз ан и я для практич еск их занят ий по биологической химии - страница 15

^

Практическая работа


Опыт 1. Количественное определение фосфолипидов в сыворотке крови.


Принцип метода.

Фосфолипиды осаждаются трихлорацетатной кислотой (ТХАК) вместе с белками крови. В осадке после минерализации определяют содержание фосфора.

^ Материальное обеспечение:

сыворотка крови, 10 % раствор ТХАК, 56 % раствор хлорной кислоты, раствор аммония молибденовокислого, 1% раствор аскорбиновой кислоты, стандартный раствор КН2РО4 (0,05 мг в 1 мл), центрифужные пробирки, центрифуга, водяная баня, ФЭК, пипетки, пробирки, микропипетки.

^ Ход работы.

В центрифужную пробирку наливают 0,2 мл сыворотки крови, 2 мл дистиллированной воды. Добавляют 3 мл 10 % раствора ТХАК и через 1-2 минуты центрифугируют на протяжении 5 мин при 2000-3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, не стряхивая пробирку. К осадку, который содержит липопротеины, добавляют 1 мл 56 % раствора HСlO4 и нагревают на кипящей водяной бане на протяжении 20-30 мин (до обесцвечивания раствора). После окончания минерализации в пробирку наливают 5 мл воды, 1 мл молибденовокислого аммония и 1 мл 1 % раствора аскорбиновой кислоты и перемешивают. Одновременно реакцию проводят со стандартным раствором фосфора. К 1 мл стандартного раствора (0,05 мг/мл) добавляют 5 мл воды, 1 мл аммония молибденовокислого и 1 мл 1 % раствора аскорбиновой кислоты и перемешивают. Через 15-20 мин растворы колориметрируют на ФЭКе, используя красный светофильтр и кюветы на 10 мм против воды.

Расчет

проводят по формуле:
Ао · 0,05
Общие липиды сыворотки = -------------- г 25 мг/мл или г/л
Аст · 0,2
Ао – оптическая плотность опытной пробы; Аст – оптическая плотность стандартного раствора; 0,05 – содержание фосфора в стандартном растворе (мг/мл ); 0,2 – объем взятой для опыта сыворотки; 25 – пересчет на общие липиды.
Сделать вывод.

^ Клинико-диагностическое значение.

Содержание общих фосфолипидов в сыворотке крови 1,5-3,6 г/л, а лецитина – 0,75-1,2 г/л. Общую концентрацию фосфолипидов определяют по содержанию липидного фосфора, на долю которого приходится 4 % относительной молярной массы фосфолипидов (0,1-0,15 г/л). Важным показателем является индекс фосфолипиды/холестерол, который при физиологичных условиях составляет 1–1,5. Этот индекс снижается при атеросклерозе, гипертонической болезни, болезнях печени.
Определение содержания липидов в крови имеет важное диагностическое значение. Повышение уровня фосфолипидов в сыворотке крови (гиперфосфолипидемия) наблюдается при тяжелой форме сахарного диабета (в 2-2,5 раз), нефрозах, застойной желтухе и др. Снижение уровня фосфолипидов (гипофосфолипидемия) наблюдается при атеросклерозе, малокровии, лихорадочных состояниях, алиментарной дистрофии, заболеваниях печени. Недостаточное поступление с едой липотропных факторов (холина, этаноламина, метионина, инозита) или недостаточное их эндогенное образование приводит к торможению синтеза фосфолипидов и к жировой инфильтрации печени.

Опыт 2. Влияние желчи на активность липазы.


Принцип метода.

Активность липазы оценивают по образованию в результате гидролиза жира жирных кислот, количество которых определяют титрованием щелочью в присутствии фенолфталеина. Гидролиз жиров удобнее всего наблюдать на примере вытяжки из поджелудочной железы (источник липазы) и молока как субстрата, жир которого находится в эмульгированном состоянии и быстро расщепляется на глицерин и жирные кислоты. Если в пробу добавить желчь, то липаза активируется и гидролиз жира протекает быстрее.

^ Материальное обеспечение:

панкреатин, молоко кипяченое и предварительно разведенное 1:1, желчь, 0,5 % спиртной раствор фенолфталеина, 0,05 н NаOH, водяная баня или термостат, микробюретки, пипетки.

^ Ход работы.

В две пробирки или колбочки наливают по 10 мл молока и по 0,5 мл панкреатина. В одну пробирку доливают 1 мл воды, а в другую – 1 мл желчи. Содержание пробирок хорошо перемешивают. Из каждой пробирки отбирают по 1 мл смеси в другие пробирки, добавляют 1-2 капли 0,5 % раствора фенолфталеина и сразу же титруют 0,05 н раствором натрия гидроксида до появления слаборозового цвета, который не исчезает на протяжении 30 секунд. Пробирки с остатком смеси помещают в водяную баню или термостат при 37˚ С. Через каждые 10-15 минут из них отбирают по 1 мл смеси и проводят титрование, как и в предыдущий раз. Делают 4-5 таких определений. Результаты выражают в мл раствора щелочи, которую потратили на титрование.
Полученые данные вносят в таблицу и строят кривую, откладывая по оси абсцисс время в мин, а по оси ординат – количество NаОН в мл, которое пошло на титрование.

Условия опыта
0 мин
15 мин
30 мин
45 мин
60 мин
Количество NаОН, мл
Липаза, активированная желчью





Липаза без желчи





^ Клинико-диагностическое значение.

Переваривание липидов происходит в основном в кишечнике под действием активной панкреатической липазы, потому что в желудочном соке липаза малоактивна и действует только на эмульгированный жир, например молока, для лучшего переваривания. Липиды должны быть эмульгированными. Главным эмульгатором липидов является желчь. Поскольку желчь эмульгирует жиры, при добавлении желчи липаза активируется и гидролиз жиров происходит с большей скоростью. Так как липаза является основным энзимом для переваривания липидов, изменения ее активности могут свидетельствовать о нарушении определенных звеньев липидного обмена. Дефицит панкреатической липазы вызывает панкреатогенную стеаторею, которую наблюдают при хроническом панкреатите, наследственной гипоплазии pancreas, наследственном или приобретенном дефиците панкреатической липазы, а также при муковисцидозе. Содержание желчных пигментов в кале при таких состояниях сопровождается снижением содержания свободных жирных кислот и значительным приростом нерасщепленных жиров. Нарушение эмульгирования, пищеварения и всасывания липидов и жирорастворимых витаминов могут вызываться также заболеваниями печени, желчного пузыря или желчных путей (желчекаменная болезнь).

^ Контроль выполнения лабораторной работы


1. В чем заключается принцип метода определения фосфолипидов в сыворотке крови?
A. В осаждении фосфолипидов трихлорацетатной кислотой и определении содержания фосфора
B. В образовании комплексного соединения при присутствии ацетатного ангидрида и смеси ацетатной и сульфатной кислот
C. В образовании синего цвета с 2,6-дихлорфенолиндофенолом и восстановлении аскорбиновой кислотой
D. В образовании с 2-тиобарбитуровой кислотой цветного триметинового комплекса
E. В образовании цветных продуктов с оксиметилфурфуролом
2. Указать содержание общих фосфолипидов в норме:
А. 0,25 – 1,25 г/л
В. 1,52 – 3,62 г/л
С. 3,75 – 5,40 г/л
Д. 10,15 – 12,30 г/л
Е. 9,80 – 15,72 г/л
3. Каким образом можно оценить активность липазы?
А. По способности энзима гидролизовать пептидные связи
В. По количеству образованной пировиноградной кислоты
С. По образованию в результате гидролиза жирных кислот, количество которых определяют титрованием в присутствии фенолфталеина
Д. По способности ингибировать восстановление нитротетразолия синего в присутствии НАДН2
Е. По способности обесцвечивать метиленовую синьку при ее восстановлении альдегидом
4. Человек длительное время ограничивает употребление продуктов, которые содержат фосфолипиды. К каким метаболическим нарушениям это может привести?
5. Анализ сыворотки крови человека - 5 ммоль/л общего холестерина, 3,2 ммоль/л фосфолипидов, 1,5 ммоль/л триглицеридов. Отвечают ли эти показатели норме? Как называется такое состояние и когда оно бывает?
6. Концентрация фосфолипидов в крови составляет 0,7 г/л. Как называется такое состояние и о каких метаболических нарушениях свидетельствует?

^ Примеры тестов „Крок-1”


1. Потерпевший от укуса змеи едва не умер из-за интенсивного гемолиза. Анализ крови показал необычно высокое содержание лизолецитина. Токсичный эффект был обусловлен наличием в змеином яде:
А. Фосфолипазы А1
В. Фосфолипазы А2
С. Фосфолипазы С
Д. Фосфолипазы Д
Е. Нейраминидазы
2. У больных сахарным диабетом наблюдается повышение содержания свободных жирных кислот (НЭЖК). Причиной этого может быть:
А. Накопление в цитозоле пальмитоил-КоА
В. Активация утилизации кетоновых тел
С. Активация синтеза аполипопротеинов А1, А2, А4
Д. Снижение активности фосфатидилхолинхолестеринацилтрансферазы плазмы крови
Е. Повышение активности триглицеридлипазы
3. При лабораторном обследовании крови больного, взятой натощак, обнаружено, что сыворотка имеет белый цвет, содержание общих липидов – 20 г/л, холестерина – 9 мМ/л. После центрифугирования сыворотки на поверхности образуется белая пленка, что позволяет допустить увеличение в крови хиломикронов. Снижение активности какого фермента может повлечь такое явление?
А. Липазы поджелудочной железы
В. Панкреатических фосфолипаз
С. Лецитинхолестеринацилтрансферазы
Д. Липазы жировой ткани
Е. Липопротеинлипазы крови
4. В результате длительного употребления жирной еды у больного развилась алиментарная гиперлипемия, которая главным образом может быть следствием повышения содержания:
А. Фосфолипидов
В. Холестерина
С. Гликолипидов
Д. Хиломикронов
Е. Триглицеридов
5. После приема жирной еды у больного появляются тошнота и изжога, имеет место стеаторея. Причиной такого состояния может быть:
А. Недостаточность амилазы
В. Повышение выделения липазы
С. Нарушение синтеза фосфолипазы
Д. Нарушение синтеза трипсина
Е. Недостаточность желчных кислот

^ Индивидуальная самостоятельная работа студентов


1. Метаболизм сфинголипидов в норме и при патологии; клиническое значение, нарушение обмена сфинголипидов.

profilaktika-i-ochishenie-pochek-kniga-pervaya-9.html
profilaktika-i-preduprezhdenie-infekcionnih-zabolevanij.html
profilaktika-i-preduprezhdenie-pravonarushenij-analiza-gbou-sosh-852-v-2013-2014-uchebnom-god.html
profilaktika-i-prognozirovanie-tyazhelih-form-gestoza-u-beremennih-s-tireotoksikozom-stranica-2.html
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат