Рис 22. Схематическое изображение геномных локусов, отобранных для дальнейшего анализа, и расположение праймеров, использованных в работе


Рис 22. Схематическое изображение геномных локусов, отобранных для дальнейшего анализа, и расположение праймеров, использованных в работе.


Для каждого из исследуемых локусов были дизайнированы праймеры на экзоны, фланкирующие LTR (Gfor и Grev, рис 22), а также праймер на 3’- и 5’ - концевую часть LTR. Праймеры Gfor+Grev применяли для определения уровня транскрипции гена, а Gfor+LTRfor и Gfor+LTRfor2 - для определения уровня транскрипции LTR, расположенного в интроне анализируемого гена. В качестве матрицы для ПЦР использовали первые цепи кДНК, синтезированные с помощью олиго(dT)-праймера на суммарной РНК нормальной паренхимы яичка человека и герминогенной опухоли – семиномы.
Методом ОТ-ПЦР с праймерами Gfor+Grev и Gfor+LTRfor был определен уровень транскрипции исследуемых генов, а также уровень транскрипции LTR, находящегося в интроне (таблица 4). В результате было отобрано 9 LTR, для которых было показано, что они транскрибируются в исследуемых тканях.

Таблица 4.

Результаты ОТ-ПЦР анализа транскрипционной активности

LTR

и генов, в интроне которых они располагаются.


(цифры обозначают цикл ОТ-ПЦР, на котором появлялся соответствующий продукт;
«-» - отсутствие детектируемого продукта; в качестве положительного контроля работы праймеров использовалась ДНК плаценты человека)

Код доступа в геномных базах данных
LTRfor+Gfor
Gfor+Grev
Паренхима
Семинома
Паренхима
Семинома
BC001407
-
37
36
36
AC023201
33
39
35
34
AL352982
34-35
34-35
34
31
AC027750
36
36
31
30
AC074117
31
31
36
33
AC011468
39
-
35
36
AC008648
36
36
34-35
34-35
AC006432
34-35
34-35
38
38
AC002400
-
-
34
33
AC007390
36
-
36
33
Однако, для того, чтобы понять, действительно ли транскрипция начинается внутри LTR, необходимо было найти 5’-конец образующейся РНК. Для этого был применен метод 5’- RACE (Rapid Amplification of cDNA ends) [163]. Схема метода и полученные результаты представлены на рис 23. В качестве матрицы использовались первые цепи кДНК паренхимы и семиномы, синтезированные с использованием cap-switch эффекта [164].

Рис 23. Поиск точки начала транскрипции внутри изучаемых

LTR

.

(А)

Схема метода 5’-RACE. В качестве матрицы используются первые цепи кДНК, синтезированные с использованием «cap-switch» эффекта. На первой стадии проводят ПЦР с супрессионным адаптером А1, внутренняя часть которого комплементарна олигонуклеотиду, использованному при синтезе кДНК, и праймером на известную последовательность гена (Gfor1) (в данном случае, на последовательность близлежащего к LTR экзона); положительный контроль проводят для проверки работы праймера на кДНК. Во втором раунде ПЦР используется супрессионный адаптер А2, внутренняя часть которого комплементарна внешней части праймера А1, и заглубленный праймер на экзон (Gfor2); отрицательный контроль проводится с использованием только праймера А2 для проверки качества работы супрессионных адаптеров.

(Б)

Результаты 5’-RACE для LTR, расположенных в интронах генов SLB и SLC.
РНК гена
РНК, образующаяся с промотора LTR
Для всех LTR, транскрибирующихся в паренхиме и семиноме, было проведено два раунда ПЦР с праймерами на 5’- адапторную последовательность кДНК и на близлежащий к LTR экзон. В результате продукт был получен только в случае LTR, расположенного между 23 и 24 экзонами гена SLB (selective LIM binding factor, rat homolog; AC074117) и между 5 и 6 экзонами гена SLC (solute carrier family 4; AC027750). Эти продукты были отсеквенированы и оказалось, что точка начала транскрипции находится внутри LTR на границе R и U5 областей (826 нуклеотид консенсусной последовательности человек-специфического LTR), что совпадает с полученными нами ранее данными о точке начала транскрипции LTR семейства HERV-K. Таким образом, было показано, что из 13 человек-специфических LTR, расположенных в интронах известных генов в противоположной направлению транскрипции гена ориентации и удаленных от ближайшего экзона не более чем на 5 т.п.н., только 2 служат промоторами для транскриптов, перекрывающихся с экзонами клеточного гена. В дальнейшем проводился анализ только двух данных локусов.
Для более полной характеристики этих двух случаев был определен уровень транскрипции генов SLB и SLC, а также находящихся в них LTR для еще десяти тканей человека: скелетной мышцы, печени, сердца, легкого (нормы и опухоли), гиппокампа и эмбриональных тканей мозга (лобной доли, затылочной коры, базальных ядер и гипоталамуса) (таблица 5). Транскрипционная активность LTR, находящегося в интроне гена SLC, была показана только для нормальной паренхимы яичка, семиномы и эмбриональных затылочной коры, гипоталамуса и лобной доли. Причем во всех случаях уровень транскрипции LTR был ниже уровня транскрипции гена.
Транскрипт LTR, находящегося между 23 и 24 экзонами гена SLB, был найден во всех проанализированных тканях кроме нормальной ткани легкого. В большинстве случаев, как и для LTR в гене SLC, уровень транскрипции LTR оказался в 4-8 раз ниже уровня транскрипции гена (эмбриональные лобная доля и гипоталамус, печень, лёгкое (опухоль) и гиппокамп). В случае эмбриональных базальных ядер и затылочной коры LTR и ген транскрибируются на одном уровне. Для скелетной мышцы, сердца, паренхимы яичка и семиномы был показан более высокий уровень транскрипции LTR по сравнению с геном. Особого интереса заслуживает нормальная паренхима яичка, в которой LTR транскрибируется в 16 раз интенсивнее гена.
Для доказательства того, что во всех случаях мы имеем дело именно с транскриптами, комплементарными РНК гена, был проведен синтез первых цепей кДНК с праймером, избирательно связывающимся с антисмысловыми к гену РНК. После этого был поставлен ОТ-ПЦР с праймерами LTRfor и Gfor. Во всех случаях ПЦР-продукт получался на тех же циклах, как и при амплификации кДНК, синтезированной с oligo(dT)-праймером. Следовательно, найденные нами ранее транскрипты LTR действительно являются антисмысловыми к гену. А для доказательства того, что транскрипция антисмысловых РНК начинается внутри LTR, были поставлены ОТ-ПЦР с праймерами на 5’- конец LTR (LTRfor2) и на экзон анализируемого гена (Gfor). Как видно из таблицы 5, в большинстве случаев продукт не детектировался или же появлялся на значительно более поздних циклах, из чего следует, что промотором для антисмысловых транскриптов в этих случаях действительно служит 3’-конец LTR. Однако при анализе кДНК четырех тканей в случае гена SLB (гиппокамп и эмбриональные затылочная кора, гипоталамус и лобная доля) продукты ОТ-ПЦР с праймерами LTRfor2+Gfor и LTRfor+Gfor появлялись практически на одинаковых циклах. Можно предположить, что в этих тканях присутствует дополнительный промотор, расположенный в 5’-концевой части LTR или вышележащий относительно LTR и сонаправленый с ним.

Таблица 5. Результаты анализа уровня транскрипции генов SLB и SLC, а также LTR, расположенных в интронах этих генов.


(цифры обозначают цикл ОТ-ПЦР, на котором появлялся соответствующий продукт;
«-» - отсутствие детектируемого продукта; в качестве положительного контроля работы праймеров использовалась ДНК плаценты человека)

ткань


SLB


SLC


Gfor+
Grev
Gfor+
LTRfor
Gfor+
LTRfor2
Gfor+
Grev
Gfor+
LTRfor
Gfor+
LTRfor2
Паренхима
35
31
37
31
36
-
Семинома
32
31
39
30
36
-
эмбриональные базальные ядра
36
36
-
34
-
-
эмбриональная затылочная кора
32
33
33
30
32
35
эмбриональный гипоталамус
33
35
36
30
33
36
эмбриональная лобная доля
33
35
36
31
35
39
Печень
34
36
-
36
-
-
легкие (норма)
33
-
-
33
-
-
легкие (опухоль)
31
35
-
36
-
-
Сердце
34-35
33
-
-
-
-
Гиппокамп
33
36
36
28
-
-

А.


Б.




ткань
LTRfor+
SLBrev1
LTRfor+
SLBrev2
LTRfor+
SLBrev3
LTRfor+
SLBrev4
LTRfor+
SLBrev5
LTRfor+
SLBrev6
легкие (опухоль)
35
35
37
-
-
-
печень
37
36
36
-
-
-
эмбр. базальные
ядра
36
36
36
-
-
-
паренхима
32
33
33
33
33
33

В.




ткань
LTRfor+
SLCrev1
LTRfor+
SLCrev2
LTRfor+
SLCrev3
LTRfor+
SLCrev4
эмбриональная
затылочная кора
32
32
32
33
эмбриональный
гипоталамус
36
36
36
36
паренхима
33
33
33
37

Рис 24

. Схема расположения праймеров, использованных для определения 3’-конца транскриптов, начинающихся в LTR (A) и результаты серии ОТ-ПЦР для транскриптов LTR, находящихся в генах SLB (Б) и SLC (В). (цифры обозначают цикл ОТ-ПЦР, на котором появлялся соответствующий продукт; «-» - отсутствие детектируемого продукта; в качестве положительного контроля работы праймеров использовалась ДНК плаценты человека)


После этого была предпринята попытка определить 3’-конец транскриптов, начинающихся в LTR, расположенных в интронах генов SLB и SLC. Нам не удалось получить необходимые результаты с помощью метода 3’-RACE, поэтому мы решили провести ОТ-ПЦР с праймером на 3’-конец LTR и серией праймеров, постепенно удаляющихся от LTR (рис 24).
В результате серии ОТ-ПЦР было показано, что в случае гена SLB существует, по крайней мере, 2 типа транскриптов: один включает в себя только экзон 23 (транскрипт 1), а второй – экзоны 23 и 22 (транскрипт 2) (рис 25). Интересно отметить, что «длинный» транскрипт был найден только в нормальной паренхиме яичка, для которой была показана значительно большая активность LTR по сравнению с геном. В случае гена SLC 3’-конец транскрипта найден не был, но было определено, что весь экзон 5 входит в его состав (транскрипт 3).

1 ... 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат