ВВЕДЕНИЕ - Молекулярно-биологическая диагностика и мониторинг минимальной остаточной болезни в лечении острых лейкозов...

ВВЕДЕНИЕ


Актуальность темы исследования
Среди всех онкологических заболеваний у детей первого года жизни острые лейкозы (ОЛ) по частоте встречаемости находятся на втором месте: заболеваемость в разных странах мира колеблется в пределах 30,0-32,0 на 1 млн. дестcкого населения соответствующего возраста [10,191,254]. Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) у детей первого года жизни составляет от 2,5 до 5% всех случаев ОЛЛ у детей [41,190,347,372]. На долю острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) у детей первого года жизни приходится 7-13% от общего числа случаев ОМЛ у детей [48,162,276,382,386,453].
В настоящее время в Российской Федерации (РФ) достигнуты значительные успехи в лечении ОЛЛ и ОМЛ у детей старше 1 года, неуклонно повышается бессобытийная и общая выживаемость пациентов, снижается частота развития рецидивов [4,6,13,15]. В то же время результаты терапии ОЛЛ у детей первого года жизни остаются неудовлетворительными: бессобытийная выживаемость редко превышает 45%, а основной причиной неудачи терапии являются рецидивы [14,33,58,223,236,237,334,347,395,444,454]. На сегодняшний день наиболее эффективным способом прогнозировать развитие рецидивов считается определение минимальной остаточной болезни (МОБ). Для этой цели применяются такие высокочувствительные методы клинической лабораторной диагностики как многоцветная проточная цитометрия и различные варианты полимеразной цепной реакции (ПЦР). Однако биологические особенности ОЛ у детей первого года жизни требуют создания специальных методов выявления МОБ с последующим сравнительным анализом полученных результатов между собой и оценкой вероятности развития рецидивов.
Актуальность создания системы мониторинга МОБ у детей этой возрастной группы обусловлена еще и тем, что в Российской Федерации Л.Г. Фечиной разработан оригинальный отечественный протокол MLL-Baby для терапии ОЛЛ у детей первого года жизни [108], который предусматривает многократное определение МОБ. Это, в свою очередь, обуславливает необходимость установления роли наличия и величины МОБ в различные точки наблюдения для прогнозирования исходов терапии.
Определение МОБ невозможно без всесторонней оценки инициальных характеристик лейкозных клеток, включая наличие и тип перестройки гена MLL (myeloid-lymphoid leukemia, mixed-lineage leukemia), расположенного в хромосомном районе 11q23 [99,214,447], других молекулярно-генетических, а также цитогенетических характеристик и иммунофенотипа опухолевых бластов с использованием стандартного цитогенетического исследования, флуоресцентной гибридизации in situ, ПЦР, проточной цитометрии. Более того, считается, что целый ряд объективных факторов затрудняют диагностику ОЛ у детей первого года жизни: криптические варианты транслокаций, большое разнообразие перестроек 11q23/MLL, существование различных типов химерных транскриптов с участием гена MLL, нестабильность иммунофенотипа опухолевых бластов, однако изучению этих аспектов посвящены лишь единичные работы [230,319,343,377].
Показано, что клинические особенности ОЛ и чувствительность к терапии зависят не только от наличия перестройки гена MLL, но и от его гена-партнера [324,335]. которых на сегодняшний день известно 79 [432]. Наиболее частыми партнерами MLL являются гены AF4, MLLT1 MLLT3, MLLT10, MLLT4, ELL, на долю которых суммарно приходится около 85% всех случаев MLL-позитивных ОЛ, как у детей, так и у взрослых [288,319,432]. В то же время, за счет оставшихся 15% и достигается большое разнообразие химерных генов с участием MLL, и именно их биологические особенности и клинические характеристики ОЛ, ассоциированных с редкими перестройками гена MLL являются наименее изученными. Традиционно считается, что наиболее неблагоприятной при ОЛЛ является транслокация t(4;11)/MLL-AF4, в то время как прогноз для пациентов с t(11;19)/MLL-MLLT1 и t(9;11)/MLL-MLLT3 несколько лучше [335]. С другой стороны, в рамках проспективного исследования Interfant-99 пациенты с любой из вышеперечисленных транслокаций имели сходную величину бессобытийной выживаемости [33]. Наиболее неблагоприятными транслокациями при ОМЛ являются t(10;11)(p12;q23)/MLL-MLLT10 и t(6;11)(q27;q23)/MLL-MLLT4 [324].
Ранее изучение ОЛ у детей первого года жизни часто сводилось к исследованию характеристик пациентов, имеющих перестройки 11q23/MLL, и не уделялось должного внимания группе пациентов без данных перестроек. Вместе с тем, помимо перестроек 11q23/MLL в исследуемой возрастной группе могут выявляться и другие цитогенетические и молекулярно-генетические аберрации, среди которых особый интерес представляет транслокация t(7;12)(q36;p13) [215], которая специфична для ОМЛ у детей первого года жизни, ассоциирована с неблагоприятным прогнозом заболевания и во многих случаях является криптической.
Таким образом, оценка МОБ, базирующаяся на основе анализа инициальных цитогенетических, молекулярно-генетических и иммунофенотипических свойств опухолевых бластов при ОЛ у детей первого года жизни является актуальным вопросом детской гематологии/онкологии и клинической лабораторной диагностики.
Степень разработанности темы исследования
Комплексная характеристика ОЛ у детей первого года жизни с использованием данных цитогенетики, молекулярной генетики, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), иммунофенотипирования как при наличии перестроек 11q23/MLL, так и при их отсутствии встречается крайне редко [226], а в нашей стране ранее не проводилась. Нерешенными остаются вопросы о частоте встречаемости и спектре перестроек 11q23/MLL, их взаимосвязи с возрастом, структуре химерных генов с участием MLL, характеристике иммунофенотипа опухолевых бластов при ОЛЛ и ОМЛ. Выявление МОБ с применением химерных транскриптов в данной возрастной группе ранее не проводилось. Не выполнялась оценка сопоставимости результатов мониторинга МОБ методами проточной цитометрии и обратно-транскриптазной ПЦР. Роль МОБ в оценке прогноза при лечении по российскому мультицентровому протоколу MLL-Baby неизвестна.
Цель исследования
Разработать и внедрить в практику систему определения минимальной остаточной болезни для мониторинга лечения острых лейкозов у детей первого года жизни на основе инициальных молекулярно-генетических и иммунологических характеристик бластных клеток.
Задачи исследования

  1. Изучить кариотип опухолевых бластов, а также спектр и частоту перестроек 11q23/MLL при ОЛ у детей первого года жизни.

  2. Найти взаимосвязь между возрастом и выявлением перестроек 11q23/MLL при ОЛЛ и ОМЛ у детей первого года жизни.

  3. Установить взаимосвязь между структурой химерных генов с участием MLL и клинико-лабораторными характеристиками ОЛ у детей первого года жизни.

  4. Разработать методический подход для выявления транслокации t(7;12)(q36;p13).

  5. Дать характеристику иммунофенотипу опухолевых бластов при ОЛЛ и ОМЛ у детей первого года жизни в зависимости от наличия перестроек 11q23/MLL.

  6. Оценить возможность использования антигена NG2 для мониторинга МОБ при ОЛЛ из B-линейных предшественников.

  7. Провести сравнительный анализ двух методов определения МОБ при ОЛЛ у детей первого года жизни - проточной цитометрии и обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции с детекцией химерных транскриптов с участием MLL.

  8. Оценить связь МОБ в костном мозге с бессобытийной выживаемостью и развитием рецидивов при терапии ОЛЛ у детей первого года жизни по протоколу MLL-Baby.

  9. Оценить роль использования периферической крови для определения МОБ у детей первого года жизни с ОЛЛ, получающих терапию по протоколу терапии MLL-Baby.

Научная новизна исследования
Впервые в РФ в группе пациентов первого года жизни с ОЛ определены частота и спектр перестроек 11q23/MLL при ОЛЛ и ОМЛ, а также описаны различные механизмы формирования химерных генов с участием MLL, включая реципрокные транслокации (73,6%), транс-сплайсинг (15,3%) и инсерции (11,1%).
Были выявлены закономерности в локализации точек разрыва в ДНК гена MLL в зависимости от типа ОЛ у детей первого года жизни. При ОЛЛ наиболее частой зоной разрыва в ДНК гена MLL является 11-й интрон, а при ОМЛ — 9-й интрон.
Впервые в нашей стране были описаны различные типы химерных транскриптов в зависимости от зоны слияния в MLL и генах-партнерах. У пациентов с ОЛЛ выявлено 9 транскриптных вариантов химерного гена MLL-AF4, 5 транскриптных вариантов MLL-MLLT3, 3 — MLL-MLLT1, 2 — MLL-EPS15. Среди различных транскриптов MLL-AF4 наиболее часто был обнаружен вариант со слиянием 11 экзона гена MLL и 4 экзона гена AF4 – в 8 случаях из 26 (30,8%). Среди 5 транскриптных вариантов химерного гена MLL-MLLT3 преобладал e11e6, обнаруженный в 3 из 7 случаев. Из 14 пациентов с наличием химерного гена MLL-MLLT1 7 имели вариант с местами слияния в 11 экзоне гена MLL и 2 экзоне MLLT1, 6 — вариант е10е2 и двое — е9е2. При ОМЛ оценка структуры химерных транскриптов выявила по 4 транскриптных варианта MLL-MLLT3 и MLL-MLLT10 и 1 — MLL-MLLT11. У пациентов с MLL-MLLT3 преобладал вариант e11e6, обнаруженный в 4 из 7 случаев. Среди пациентов с наличием MLL-MLLT10 было выявлено по 2 случая химерных транскриптов е8е15, е9е9, e9е10 и 1 случай e9e4. Среди генов-партнеров MLL наиболее разнообразна была локализация зон слияния в генах AF4 (при ОЛЛ) и MLLT10 (при ОМЛ)
Впервые определена частота встречаемости перестроек гена MLL с одновременной делецией 3’-конца гена MLL при ОЛ у детей первого года жизни, которая составляет 7,6%.
Охарактеризован иммунофенотип опухолевых бластов у детей первого года жизни с ОЛЛ и ОМЛ, который ассоциирован с наличием перестроек 11q23/MLL.
Впервые установлена негативная прогностическая роль сохранения МОБ в костном мозге при ОЛЛ у детей первого года жизни, получающих терапию по протоколу MLL-Baby.
Теоретическая и практическая значимость
Разработан алгоритм диагностики и определения МОБ, позволяющий выявлять любую перестройку 11q23/MLL, а также проводить оценку МОБ при острых лейкозах у детей первого года жизни.
Показано, что длительное сохранение МОБ в костном мозге при ОЛЛ у детей первого года жизни, получающих терапию по протоколу MLL-Baby, связано с высокой вероятностью развития рецидива.
Детально охарактеризованы частые и редкие перестройки 11q23/MLL. При ОЛЛ установлена взаимосвязь возраста пациентов с выявлением перестроек 11q23/MLL.
Разработана комбинация праймеров и флуоресцентных зондов для выявления химерных транскриптов MLL-EPS15, MLL-MLLT10, MLL-MLLT11, MLL-MYO1F методом ПЦР в режиме реального времени.
Показана возможность выявления транслокации t(7;12)(q36;p13) методом FISH с использованием трехцветного флуоресцентного зонда.
Описаны аберрации иммунофенотипа, выявление которых дает возможность предположить наличие перестроек 11q23/MLL и требует их верификации с использованием всех доступных молекулярно-генетических методов.
Использование предложенного алгоритма мониторинга МОБ при ОЛ у детей первого года жизни на основании инициальных характеристик опухолевых бластов дает возможность надежно выявлять перестройки 11q23/MLL, в том числе редкие, ранее неописанные, что позволяет развивать знания о биологии опухолевого процесса и, тем самым, совершенствовать терапию. Полученные в работе данные создают предпосылки для детального изучения роли минимальной остаточной болезни при ОМЛ.
Эффективность разработанного диагностического метода у детей первого года жизни позволяет считать перспективным его использование для улучшения результатов лечения ОЛ у пациентов различных возрастных групп.
Методология и методы исследования
В работе проанализированы данные 254 пациентов в возрасте от 1 до 365 дней с установленным диагнозом ОЛ в период с 08.06.1999 по 24.03.2013.
Для проведения исследования применялись различные методы клинической лабораторной диагностики. Для первичной диагностики использовались цитогенетический анализ, иммунофенотипирование, флуоресцентная гибридизация in situ, различные варианты ПЦР, секвенирование нуклеотидных последовательностей. Определение МОБ выполняли методами ОТ-ПЦР, ПЦР-РВ и многоцветной проточной цитометрией. Для статистической обработки рассчитывали адекватные поставленным задачам непараметрические критерии, исходя из характера сравниваемых величин и количества пациентов в группах.
Положения, выносимые на защиту

  1. С целью поиска маркеров для последующего мониторинга МОБ необходимо использование комплекса методов клинической лабораторной диагностики, включая проточную цитометрию, стандартное цитогенетическое исследование, флуоресцентную гибридизацию in situ и различные варианты полимеразной цепной реакции.

  2. Предложенный комплексный подход к определению МОБ показал высокую качественную сопоставимость между результатами проточной цитометрии и обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции.

  3. Использование данных определения МОБ позволило прогнозировать результаты лечения детей первого года жизни с ОЛЛ по протоколу MLL-Baby.

Степень достоверности и апробация результатов
Степень достоверности полученных результатов основана на достаточном количестве выполненных исследований с использованием современных методов клинической лабораторной диагностики, применении коммерчески доступных калибраторов и контрольных материалов, участии во международных системах контроля качества, а также на использовании адекватных сформулированным задачам методов статистической обработки данных с применением специального программного обеспечения.
Материалы работы были представлены на V-IX Российских симпозиумах «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний» (Москва, 2007, 2009, 2011, 2013, 2015), Совещании мультицентровой группы «Москва-Берлин» по изучению острых лейкозов у детей (Москва, 2007), Х Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы детской онкологии и гематологии» (Минск, 2007), 4м съезде Детских онкологов России (Москва, 2008), I Всероссийском конгрессе «Генетика опухолей кроветворной системы» (Ростов-на-Дону, 2010), Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины – возможное и реальное» (Санкт-Петербург, 2010), Национальных днях Лабораторной медицины России (Москва, 2011), Научной конференции «Актуальные вопросы онкогенетики» (Москва, 2011), XV и XVII Российских онкологических конгрессах, (Москва, 2011, 2013), Всероссийской научно-практической конференции «Клиническая лабораторная диагностика в гематологии и службе крови» (Санкт-Петербург, 2011), I и II Конгрессах гематологов России (Москва, 2012, 2014), Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярно-генетические и иммуногенетические методы диагностики в практике врача гематолога» (Санкт-Петербург, 2013), IV Межрегиональном совещании Национального общества детских гематологов и онкологов (Москва,2014), 12-19м конгрессах Европейской гематологической ассоциации (Вена, 2007; Берлин, 2008; Копенгаген, 2009; Барселона, 2010; Лондон, 2011; Амстердам, 2012; Стокгольм, 2013; Милан, 2014), 49-56й ежегодных конференциях Американского общества гематологов (Атланта, 2007; Сан-Франциско, 2008; Новый Орлеан, 2009; Орландо, 2010; Сан Диего, 2011; Атланта, 2012; Новый Орлеан, 2013, Сан-Франциско, 2014), 39-42м и 44-46м конгрессах Международного общества детской онкологии (Мумбай, 2007, Берлин, 2008, Сан-Паулу, 2009, Бостон, 2010, Лондон, 2012, Гонконг 2013, Торонто, 2014).
По теме диссертации опубликовано 17 статей, в том числе 15 — в изданиях, рекомендованных в перечне Высшей Аттестационной Комиссии Министерства образования и науки РФ, а также 1 статья в зарубежном журнале.
Личный вклад автора
Личный вклад состоит в детальном планировании научной работы, тщательном анализе научной литературы, посвященной проблеме ОЛ у детей первого года жизни. Автор принимал непосредственное участие подборе, отработке условий проведения молекулярно-генетических исследований методом ПЦР в режиме реального времени. Автором были сформированы базы данных по каждому из направлений диссертационной работы, проведены статистическая обработка полученных данных, обобщение и интерпретация полученных результатов, сформулированы научно обоснованные выводы, а также положения, выносимые на защиту, и практические рекомендации, написаны текст диссертации и автореферата, основные публикации.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Диссертационная работа, включая цели, задачи, научную новизну, предмет исследования, а также полученные результаты, соответствует паспорту специальности 14.01.21 – Гематология и переливание крови, в том числе, указанных в п.1 «Изучение кроветворения и состава крови в эксперименте и у человека … с использованием морфологических, гистохимических, иммунологических, генетических, молекулярно-биологических, культуральных и других методов исследований», в п. 3 «Этиопатогенетические механизмы становления и развития наследственных и приобретенных болезней системы крови с использованием морфологических, биохимических, иммунологических, генетических, молекулярно-биологических и других, в том числе экспериментальных, методов исследований»; п.4 «Диагностика и клиника наследственных и приобретенных болезней системы крови, а также патологических состояний, возникающих в экстремальных условиях, с привлечением широкого спектра лабораторных, клинических и инструментальных исследований, с использованием методов статистического анализа и обобщения клинических данных». А также полностью соответствует паспорту специальности 14.03.10 – «Клиническая лабораторная диагностика», в том числе указанных в п.1 …«Лабораторные исследования для диагностики и функциональной диагностики заболеваний, характеристики тяжести, периода и срока болезни, прогноза, контроля за лечением и его результатами»…; в п.4 …«Онкоиммунология»…,; п.6 …«Цитогенетические и молекулярно-генетические методы исследований. Исследование структуры хромосомного набора или отдельных хромосом делящихся соматических, мейотических или интерфазных клеток. Выявление вариаций в структуре участка ДНК, расшифровка первичной последовательности оснований».
4 5 6 7 8 9 ... 41 Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат
Реферат